蛋白互作Pulldown技术介绍

引言
细胞就像是一个池塘，细胞中的各种蛋白就如同池塘中的鱼，这时候我们从细胞这个池塘中“钓”我们想要的鱼，就是蛋白互作。可以采用的“钓鱼”技术有：Pull Down、免疫沉淀/免疫共沉淀、酵母双杂交等。

什么是PullDown
PullDown类似于大家熟知的免疫沉淀/免疫共沉淀，通过固定在固相载体（鱼竿）上的已知诱饵蛋白（鱼饵），去结合细胞（池塘）中的未知靶蛋白（鱼）。

不同于免疫沉淀/免疫共沉淀这种基于抗体-抗原相互作用的方法，Pull Down是在已知的诱饵蛋白上，重组表达设计一个亲和标签，然后通过这个标签和固定了特异性亲和配体的固相介质进行结合，然后去捕获与之相互作用的蛋白，形成一个由这三个部分组成的复合物。诱饵蛋白和靶蛋白的复合物可以通过相应的方法，从固相介质上洗脱，通过SDS-PAGE进行电泳分析，并结合Western blot或质谱等进一步鉴定，确定相互作用的蛋白质性质等。

固相介质可以是琼脂糖微球、磁性微球等，在PullDown实验中的作用是固定和支持我们的诱饵蛋白，并通过固液分离，将我们的靶蛋白从其所处的混合物中纯化出来。

PullDown种类
20世纪80年代末，Smith & Johnson等人使用谷胱甘肽-S-转移酶（即GST）作为重组标签，在原核体系中表达和纯化GST融合蛋白。此后GST标签作为一种工具，开始应用于蛋白互作领域。其他可以使用的还有His标签、Strep-tag等。

种类	GST-Pull Down	His-Pull Down	Strep-Pull Down
原理	使用固定GSH配体的微球，结合带有谷胱甘肽-S-转移酶的诱饵蛋白，最终捕获细胞裂解液中能与诱饵蛋白结合的靶蛋白。	使用金属螯合层析介质，结合带有组氨酸标签（6×His、8×His、10×His）的诱饵蛋白，然后捕获细胞裂解液中的靶蛋白。	使用偶联有Streptactin的固相介质，结合含有Strep-tag或Strep-tag II标签的诱饵蛋白，再从细胞裂解液中纯化出互作靶蛋白
应用	1、寻找与已知蛋白互作的未知蛋白。 2、预测和证明蛋白与蛋白之间的互作。 3、利用诱饵蛋白研究调控后，细胞中靶蛋白含量水平的变化，从而研究细胞信号传导、基因调控、代谢调控等，对于药物开发、基因治疗等有很大帮助。
特点	操作简单，检测的是蛋白和蛋白之间的直接作用。

下图以GST-Pull Down为例展示了实验的流程：

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