几种常见的蛋白质凝胶染色方法

在蛋白质组学实验中，凝胶电泳是研究蛋白质性质的一种相对简单、快速和高灵敏度的工具，是分析复杂蛋白质混合物、某一蛋白质或者多肽相对含量的一种常用方法，是一种检测蛋白质纯度、评估蛋白质分子量的强有力的生化分析方法。在电泳系统中,蛋白条带染色是十分重要的的环节。条带染色直接关系到实验结果的观察和样品后续使用。染色方法有多种，目前实验室中最常用的染色方法有考马斯亮蓝染色、银染、负染等。

蛋白质凝胶染色方法

01.考马斯亮蓝染色
考马斯亮蓝染色最早由Fazekas等在1963年用于醋酸纤维素膜电泳，并认为同样可用于纸电泳、琼脂糖电泳和淀粉凝胶电泳。1965年Meyer等将此方法应用于聚丙烯酰胺凝胶电泳。

1.1染色原理
考马斯亮蓝染色目前广泛运用的是考马斯亮蓝R-250。其原理是利用考马斯亮蓝分子上的芳香苯环与蛋白质的疏水区结合；同时其亚硫酸基团（-SO32-）与蛋白质的正电荷结合，使蛋白质染出蓝色条带。（如图1）

图1. 考马斯亮蓝凝胶染色结果图

1.2操作步骤

1.3常见问题及解决方法

问题	原因分析	推荐解决方法
凝胶背景过深，无法看清蛋白条带	染色时间过长	适当减少染色时间
凝胶背景过深，无法看清蛋白条带	脱色时间不足	脱色时加热
染色条带浅	染色时间短	延长染色时间染色时加热操作
染色条带浅	染色液中R-250不足	重新配置染色液后对凝胶进行染色

02银染

2.1染色原理
在碱性条件下，用甲醛将蛋白带上的硝酸银（银离子）还原成金属银，以使银颗粒沉积在蛋白带上。染色的程度与蛋白中的一些特殊的基团有关，不含或者很少含半胱氨酸残基的蛋白质有时候呈负染。（如图2）

图2. 银染凝胶染色结果图

2.2操作步骤

2.3常见问题及解决方法

问题	原因分析	推荐解决方法
凝胶背景深	电泳时凝胶被污染	更换新的电泳液，电泳槽内用纯水冲洗干净。
	染色操作时污染	使用专门的容器，使用前用纯水冲洗干净。用纯水配制试剂。操作时更换新的手套。
	显色时间过长	显色过程时刻观察凝胶变色情况，及时终止。
蛋白条带太浓	样品上样浓度过高	对样品进行稀释
样品串孔，无法分析结果	电泳点样时飘出胶孔	使用细长的枪头，将样品加至胶孔底部。制样时加入足量的loading buffer。

03PAS染色
PAS染色法主用来检测糖类，糖原或者多糖类物质（如粘多糖、粘蛋白、糖蛋白、糖脂等）中的乙二醇基（CHOH-CHOH）经过碘酸氧化，转变为二醛基（CHO-CHO），与Schiff试剂中的无色品红结合，形成紫红色染料沉积在凝胶上多糖所在处。（如图3）

图3. PAS凝胶染色结果图

04阿利新蓝染色
阿利新蓝属于阳离子染料，是显示酸性多糖物质最特异的染料，染料与酸性基团形成盐键。利用染料的不同pH及不同电解质浓度，可区分酸性多糖物质的类别。（如图4）

图4 阿利新蓝凝胶染色结果图

05碘染
在聚丙烯酰胺凝胶电泳中，白蛋白通过碘染色显示为棕色背景下的透明点，而其他蛋白质则无法显示。棕色背景是碘对凝胶的渗透作用，而碘与白蛋白的化学结合产生了脱色反应。

06金属离子染色
金属染色分为正染和负染两种，CuCl2、ZnCl2等染色法属于负染，即凝胶的背景颜色深而蛋白质条带很浅。相反，CaCl2法则属于正染色法，主要依靠金属离子、SDS、蛋白质和Tris之间的相互作用将蛋白条带进行染色。

总结

染色方法	适用范围	优点	缺点
考马斯亮蓝染色	常规蛋白质	操作简便通用性高重复性好稳定性高	试剂有刺激气味染料沾染后难以去除
银染	常规蛋白质	灵敏度高	操作繁琐试剂要求高
PAS染色	糖蛋白	染料成本低染色后无背景	试剂配制繁琐
阿利新蓝染色	糖蛋白	可区分酸性多糖物质的类别	染料价格高背景深操作较为繁琐
碘染	牛血清白蛋白、兔血清白蛋白、人血浆α 2-巨球蛋白、血青素、胰蛋白酶抑制剂	染色蛋白专一性高	适用范围窄
金属离子染色-正染	蛋白保持完整并有效回收以做进一步的结构和生物学分析	保持蛋白结构完整灵敏度高	稳定性较差不能直观看到蛋白条带染色方法不稳定，影响因素较多适用范围窄
金属离子染色-正染	蛋白保持完整并有效回收以做进一步的结构和生物学分析	染色后条带稳定能直观观察蛋白条带	染色方法不稳定，影响因素较多适用范围窄

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