一、产品介绍
BCA Protein Assay Kit是目前世界上最常用的两种蛋白浓度检测方法之一。BCA蛋白质定量包括两步反应：首先，二价铜离子(Cu2+)在碱性条件下被蛋白质的肽键还原成一价铜离子(Cu+)；其次，两个分子的BCA络合一个一价铜离子(Cu+)，形成一种在562 nm处有强吸收值的紫色复合物，而复合物的吸收值与蛋白的浓度在一定范围内呈线性相关（如图）。

使用BCA法进行蛋白质定量有以下特点：1.不受蛋白种类的影响，在20-2000 μg/mL浓度范围内有较好的线性。2.表面活性剂对浓度检测的干扰较小。但由于还原剂和螯合剂对反应有阻碍，因此本制品不适用于含有还原剂或者螯合剂的蛋白质样品的定量。

表1是试剂盒的基本组成，我们提供两种检测方案：试管和微孔板。试管方案所需样品量较大（0.1 mL）,但样品和工作液的稀释比例为1:20（V/V），所以干扰物的影响比较小；微孔板方案所需的工作液较少（200 uL），样品体积少（25 uL），但样品和工作液的稀释比例为1:8（V/V），对干扰物的耐受较差。





 


二、操作步骤

1 .BSA 标准品稀释梯度
按照表 2 制备一组蛋白质标准品。最好使用与待测样品相同的稀释液，每个稀释浓度的标准品的体积足够用于三次重复检测。




2 制备 BCA 工作液
使用下述公式来确定所需的工作液的总体积：（标准品的个数 + 待测蛋白质样品的个数）×（实验重复次数）×（用于每个样品的工作液的体积）= 所需工作液总体积；将 50 份 Solution A 与 1 份 Solution B 混合（A:B =50:1），制备工作液。

3 试管方案（样品与工作液的比例 =1:20）
①取各个稀释浓度的蛋白质标准品和待测蛋白质样品各 0.1 mL，加入到做好标记的试管中；②在每个试管中加入 2.0 mL 工作液，充分混合；③将试管密封，根据不同实验方案，选择相应的温度和时间进行孵育：标准方案：37℃，30 min；增强方案：60℃，30 min；④将所有试管冷却至室温。⑤将分光光度计波长设定在 562 nm，用 I 管空白标准品对仪器进行调零（增强方案用 F 管空白标准品对仪器进行调零），然后在 10 min内依次检测所有样品的吸光值。⑥ 将 BSA 标准品在 562nm 处经过空白校正的吸光值对其浓度（μg/mL）作图，绘制标准曲线。使用该标准曲线来确定每个待测蛋白质样品的浓度。

4 微孔板方案（样品与工作液比例 =1:8）
①取各个稀释浓度的蛋白质标准品和待测蛋白质样品各 25 μL，加入到微孔板中；②在每一个孔中加入 200 μL 工作液，并在震荡器上震荡 30 s，使其充分混合；③将微孔板密封，在 37℃孵育 30 min；④将微孔板冷却至室温，使用酶标仪测量样品在 562 nm 处的吸光值；⑤将各个标准品和待测蛋白质样品在 562 nm 处的吸光值减去空白标准品在 562 nm 处的平均吸光值；⑥将 BSA 标准品在 562 nm 处经过空白校正的平均吸光值对其浓度（μg/mL）作图，绘制标准曲线。使用该标准曲线来确定每个待测蛋白质样品的浓度。